Гемопоэтическая стволовая клетка в патогенезе болезней цивилизации, ее диагностические возможности и биотерапевтический потенциал
TekstБ – анализ клеток через 48 ч; В – анализ клеток через 72 ч; Г – анализ
клеток через 96 ч
Важно отметить, что в контролях количество клеток глиомы С6 закономерно уменьшалось, что, вероятно, следует объяснить ускоренными темпами пролиферации неопластических клеток, которые постепенно утрачивают флуоресцентную метку. Однако и в сокультуре С6/ГСК количество монопозитивных клеток линии С6 уменьшается, при этом монопозитивных клеток на 96 ч эксперимента в сокультуре с ГСК значительно меньше, чем в контроле. Сказанное выше свидетельствует в пользу переноса флуоресцентной метки из ГСК в опухолевые клетки на ранних сроках сокультивирования (до 48 ч). При этом на более поздних сроках (48—96 ч) клетки глиомы особенно интенсивно накапливали флуоресцентную метку от ГСК. Важно отметить, что в ходе сокультивирования популяция клеток ГСК практически исчезла на поздних сроках (120 ч).
Для изучения эффектов взаимодействия ГСК с опухолевыми клетками интеллектуальная система мониторинга Cell-IQ была настроена на распознавание образов и подсчет числа живых и мертвых клеток в режиме реального времени. Под живыми клетками понималась итоговая сумма образов интерфазы и митоза (2).
Рис. 12.⠀Образы опухолевых клеток по данным системы Cell-IQ.
А – адгезировавшие клетки; Б – неадгезировавшие пролиферирующие клетки (в т.ч. с признаками ранней профазы); В – мертвые клетки
Термином «пролиферирующие» были обозначены клетки, обнаруживающие прекращение функциональной активности, имеющие отчетливые признаки открепления от субстрата и характеризующиеся увеличением объема ядра и клетки в целом, округлыми контурами клеточной мембраны и светлой цитоплазмой с отсутствием патологических включений, а также другими морфологическими признаками ранней профазы. При подсчете пролиферирующих клеток также учитывались клетки, находящиеся в митозе.
Динамическое наблюдение числа опухолевых клеток, сокультивируемых с ГСК, показало зависимость антипролиферативного эффекта от соотношения внесенных в культуру клеток. К концу эксперимента кривая нарастания числа живых клеток в сокультуре С6/ГСК при соотношении 3:1 не обнаруживала значительных отличий от контрольной культуры клеток линии С6 (рис. 13).
Рис. 13.⠀Результаты сокультивирования клеток линии С6 с ГСК. По оси абсцисс – время эксперимента (ч), по оси ординат – количество клеток линии С6 в сокультурах с ГСК. Данные приведены в виде М ± s.e.m., n = 30 по каждой точке. Знаком * показаны достоверные (p <0,05) различия в количестве клеток линии С6 в сокультуре с ГСК/C6 в соотношении 1:1 и знаком ** в соотношении 3:1 по сравнению с контрольной
культурой С6
При сокультивировании клеток линии С6/ГСК в соотношении 1:1 и более к 120 ч эксперимента сократилось как общее число опухолевых клеток, так и количество пролиферирующих клеток, определяемых с помощью иммуноцитохимической окраски на PCNA (рис. 14).
При сокультивировании с клетками глиомы С6 в соотношении 1:1 ГСК оказывали на них цитостатический эффект. При увеличении количества ГСК в сочетанной культуре до 1:3 этот эффект был более очевидным, что свидетельствует о способности ГСК подавлять пролиферацию опухолевых клеток in vitro, зависящей от числа внесенных стволовых клеток (рис. 15).
Рис. 14.⠀Количество PСNA-позитивных клеток в сокультурах глиомы С6/ГСК в ходе эксперимента. А – 18 ч, Б – 36 ч, В – 54 ч, Г – 72 ч. По оси ординат указано количество пролиферирующих клеток, % от общего числа клеток в сокультуре. Данные приведены в виде среднего ± стандартное отклонение), n = 18 по каждой точке. Знаком * показаны достоверные (p <0,05) отличия между числом PCNA-позитивных клеток в сокультуре С6/ГСК в соотношении 1:3 в сравнении с контролем. Различия особенно очевидны на сроке 72 ч
Таким образом, совместное культивирование ГСК с клетками глиомы линии С6 сопровождается адгезией ГСК к опухолевым клеткам, взаимодействием с ними, развитием антипролиферативного эффекта, при этом противоопухолевый потенциал таких взаимодействий возрастает по мере увеличения количества стволовых клеток в анализируемой системе.
Рис. 15.⠀Динамика количества клеток линии С6 при сокультивировании с ГСК по данным высокоэффективной количественной микроскопии в реальном времени. Сокультивирование клеток С6/ГСК: А – 1:3, Б – 1:1, В – 3:1. В качестве контроля использована культура фибробластов; по оси абсцисс – время в ч, по оси ординат – количество клеток, млн. Данные приведены в виде среднего ± стандартное отклонение), n = 18 по каждой точке. Б, Г, Е – указано распределение клеток глиомы С6 на 117 ч наблюдения в соответствующих сокультурах по данным Сell-IQ
Взаимодействие гемопоэтических стволовых клеток с клетками злокачественных опухолей человека
Во второй части эксперимента изучалось in vitro взаимодействие ГСК человека с клетками линии U-87 глиобластомы человека, линии А549 рака легких человека и линии MCF-7 рака молочной железы человека. Спустя 24 ч наблюдений отмечали адгезию ГСК к поверхности опухолевых клеток различных линий (рис. 16).
Рис. 16.⠀Адгезия ГСК (окраска CFDA SE, λ = 488 нм) к поверхности опухолевых клеток: А – рака легких, Б – аденокарциномы молочной железы, В – глиобластомы (окрашены CMPTX, λ = 546 нм); Г – cокультура фибробластов человека и ГСК, признаки адгезии отсутствуют. Флуоресцентная лазерная микроскопия, 24 ч эксперимента. Соотношения клеток 1:1. Масштаб 400 мкм
Спустя 48 ч в цитоплазме опухолевых клеток стали проявляться включения зеленого флуоресцентного красителя CFDA SE, которым предварительно были окрашены ГСК. Признаки обмена флуоресцентной меткой были заметны во всех сокультурах, однако особенно очевидны в сокультуре ГСК с клетками рака легких А549/ГСК (рис. 17).
Рис. 17.⠀Накопление зеленой флуоресцентной метки в клетках рака легких линии А549 (изначально окрашены витальным трейсером Red CMPTX; λ = 546 нм, красный) при сокультивировании с ГСК (СFDA SE; λ = 488 нм, зеленый), 48 ч эксперимента. Лазерная сканирующая микроскопия в реальном времени. Масштаб 400 мкм
Описанный феномен был выражен среди всех линий опухолевых клеток и визуализировался с использованием мультифотонной микроскопии, что позволяет отличить транспорт флуоресцентной метки от возможного свечения ГСК, распластавшихся по поверхности опухолевых клеток. На данном сроке эксперимента транспорт флуоресцентной метки проходил только в направлении из ГСК в опухолевые клетки, однако c увеличением времени до 48—72 ч в спектре свечения ГСК, адгезировавших к поверхности клеток глиобластомы, начинали преобладать желтые тона (рис. 18, 19), что отчасти может быть связано с пересечением спектров флуоресцентного сигнала, отраженного от окрашенных SFDA (λ = 488 нм), и распластавшихся по их поверхности ГСК, окрашенных красителем Red CMTPX (λ = 546 нм).
Рис. 18.⠀Взаимодействие ГСК с опухолевыми клетками при сокультивировании в соотношении 1:1 в течение 48 ч. 1 – появление оранжево-желтого оттенка в цитоплазме ГСК, которые адгезировали к клеткам глиобластомы линии U-87. Неопластические клетки изначально окрашены витальным трейсером CMPTX (λ = 546 нм, красный), ГСК – СFDA SE (λ = 488 нм, зеленый); 2 – при этом как на поверхности, так и, возможно, в цитоплазме (указано стрелкой) клеток глиобластомы отчетливо заметны флуоресцентные тельца диаметром значительно меньше ГСК. Флуоресцентная лазерная микроскопия. Масштаб 600 мкм
Рис. 19.⠀Взаимодействие ГСК с опухолевыми клетками при сокультивировании в соотношении 1:1 в течение 72 ч. А – (1) накопление оранжево-желтого оттенка в цитоплазме ГСК, которые адгезировали к клеткам глиобластомы линии U-87. Неопластические клетки изначально окрашены витальным трейсером CMPTX (λ = 546 нм, красный), ГСК – СFDA SE (λ = 488 нм, зеленый); (2) на поверхности клеток глиобластомы видны флуоресцентные тельца диаметром значительно меньше ГСК. Б – взаимодействие ГСК (1) с клетками глиобластомы (2). Флуоресцентная лазерная микроскопия. Масштаб 600 мкм
Анализ спектра флуоресценции ГСК, адгезировавших к поверхности клетки глиобластомы, свидетельствует об увеличении в нем количества оранжево-желтых оттенков, что может быть связано с присутствием в ГСК красителя Red CMTPX, привнесенного из клеток глиобластомы в процессе межклеточного взаимодействия. Отметим, что с увеличением срока культивирования признаки переноса флуоресцентной метки не только из ГСК в ОК и наоборот были отмечены во всех сокультурах, но в контрольной культуре такие феномены зарегистрированы не были. По результатам ЦФМ, через 24 ч в сокультуре А549/ГСК регистрировалось 9,6 ± 1,3% клеток, позитивных по 2 красителям (рис. 20).
Через 36 ч совместного культивирования число дважды позитивных клеток возрастало до 13,3 ± 0,8%. Через 48 ч с момента начала исследования число дважды позитивных клеток достигло 27,4 ± 1%, а к 96 ч наблюдения количество таких клеток увеличилось до 77,5 ± 4%. Важно отметить, что параллельно увеличению количества дважды позитивных клеток уменьшалось число монопозитивных ГСК. По данным программы Kaluza, увеличение числа дважды позитивных клеток происходило за счет клеток линии А549 (табл. 3).
Примечание: данные представлены в процентах от общего числа клеток каждой группы, в М ± s.e.m., n = 9 по каждой точке. * – число дважды позитивных опухолевых клеток через 48 ч наблюдений; достоверно (p <0,05) отличается от количества дважды позитивных ГСК.
Рис. 20.⠀Гистограммы распределения клеток в сокультуре рака легких с ГСК по данным цитофлуориметрии c использованием флуоресцентных красителей: 36 ч с начала эксперимента; А1, Б1, В1, Г1 – клетки рака легкого, контроль; А2, Б2, В2, Г2 – гемопоэтические стволовые клетки, контроль; А3, Б3, В3, Г3 – сокультура ГСК с клетками рака легкого линии А549
Рис. 21.⠀Гистограммы распределения в сокультуре клеток рака молочной железы и глиобластомы с ГСК по данным цитофлуориметрии c использованием флуоресцентных красителей: А1 – клетки рака молочной железы линии MCF-7, контроль; А2 – гемопоэтические стволовые клетки, контроль; А3 – сокультура ГСК с клетками рака молочной железы линии MCF-7; Б1 – клетки глиобластомы линии U-87, контроль; Б2 – гемопоэтические стволовые клетки, контроль; Б3 – сокультура ГСК с клетки глиобластомы линии U-87
В свою очередь, уменьшение числа монопозитивных стволовых клеток может быть связано с гибелью части популяции ГСК под токсическим воздействием нарастающего количества продуктов жизнедеятельности неопластических клеток. Существенное увеличение количества дважды позитивных клеток наблюдалось к 96 ч эксперимента и в других сокультурах. Так, число клеток, позитивных в отношении 2 красителей, составляло 47,5% в сокультуре ГСК с клетками MCF-7 и 64,3% в сокультуре ГСК с клетками глиобластомы (рис. 21). При этом в сокультуре ГСК с клетками глиобластомы к концу эксперимента практически не осталось монопозитивных ГСК.
Обсуждение полученных данных
Как следует из данных эксперимента in vitro, стволовые клетки обладают подвижностью по отношению к клеткам других типов, которая особо выражена по отношению к опухолевым клеткам. В свою очередь, миграционная активность СК нейрального и ненейрального происхождения сильно различается по отношению к опухолевым клеткам нейроглиального и ненейроглиального рядов. Очевидно, данный факт иллюстрирует собой важную закономерность: стволовые и опухолевые клетки, полученные из одного источника, обладают максимальной степенью аттракции в отношении друг к другу. Этот факт хорошо иллюстрирует высокая подвижность клеток глиобластомы в пределах культуральной вставки по направлению к стволовым клеткам, мигрирующим сюда сквозь ее поры.
Однако заслуживает особого внимания тот факт, что подвижность НПК в отношении различных типов клеток линии глиобластомы тоже совсем неодинакова. Так, дифференцированные клетки 2 типов глиобластомы в 5 и 6 раз соответственно превосходят их подвижность в контроле, однако миграционная активность этого НПК в отношении ОСК превосходит контроль практически на порядок.
Высокая подвижность НПК по отношению к различным типам опухолевых клеток не является неожиданностью. Способность к непрерывной миграции из первичных герминативных зон головного мозга – одно из важнейших свойств нейральных стволовых клеток (Ярыгин, 2015; Aboody et al., 2013) и их прямых потомков – нейральных прогениторных клеток (Benedetti, 2000). Мигрируя из субвентрикулярной зоны головного мозга, потоки НСК ориентируются по градиенту концентрации сигнальных молекул (Doetsch et al., 1999), продуцируемых эндотелием кровеносных сосудов, что позволяет провести параллели. Периваскулярный способ инвазии клеток МГБ также характеризуется миграцией опухолевых элементов по пространствам Вирхова – Робина, а также распространением вдоль пенетрирующих паренхиму мозга артерий, артериол и вен. В этой связи аргументом в пользу единства механизмов, определяющих специфические взаимоотношения НПК и ОСК, являются указания на способность растущей в мозге МГБ опустошать первичные герминативные центры мозга, что довольно подробно проиллюстрировано в работах Najbauer (2012), Walzlein (2008), Ярыгина (20015), Цимбалюка (2005) и других авторов.
Данное обстоятельство свидетельствует в пользу наличия прямой связи ОСК глиобластомы и нормальных СК головного мозга человека и высших млекопитающих и, конечно, служит весомым аргументом, позволяющим рассматривать СК как важный фактор патогенеза глиом. Нельзя исключить, что способность опухоли привлекать СК наводит на мысль, что запуск и поддержание миграционной активности опухолевых клеток в значительной мере обеспечивается субпопуляцией стволовых клеток.
Относительно слабая способность культур клеток линии МСА-7 рака молочной железы и А549 рака легкого привлекать СК не должна вводить в заблуждение. Рак молочной железы – гормонально зависимая опухоль, которая по распространенности и масштабу летальности уступает только раку легких, лидирующему в общемировой статистике онкологической смертности. Не исключено, что способность привлекать стволовые клетки может быть связана с многочисленными пассажами этих линий in vitro, приводящими к потере ряда важных сигнальных механизмов. В свете сказанного обращает на себя внимание тот факт, что НПК проявляли максимальную тропность в отношении опухолей нейроэпителиального происхождения и значительно уступали ГСК в активности по направлению к опухолям иного тканевого происхождения.
ГСК, несколько уступая НПК в способности мигрировать в направлении клеток злокачественных опухолей, тем не менее активно мигрировали к неопластическим клеткам. Этот факт согласуется с данными литературы, указывающими на высокую подвижность стволовых клеток костного мозга в отношении различных линий опухолевых клеток (Nakamizo et al., 2005; Кирик и др., 2013). Их миграционные возможности немногим уступают НПК и демонстрируют принципиальные различия в этой способности с дифференцированными клетками. Нельзя не отметить, что по способности привлекать ГСК сепарированные CD133+-клетки существенно превосходят другие клетки МГБ, что также является аргументом в пользу уже высказанного предположения, что в составе популяции клеток опухоли именно ОСК обеспечивают максимальный вклад в подачу специфического сигнала, запускающего процессы миграции ГСК и клеток других типов. Следуя этой логике, можно предполагать, что онкотехнологии, основанные на создании модифицированных СК, способны обеспечить эффективное управление судьбой опухолевых стволовых клеток.
СК обладают способностью направленно мигрировать к опухолевым клеткам, но роль этого феномена в канцерогенезе МГБ практически не изучена. Идентифицировано множество хемоаттрактантов, факторов роста и других сигнальных молекул, управляющих процессами миграции и хоуминга стволовых клеток, о чем сказано ранее. Однако роль указанных выше механизмов в патогенезе глиальных опухолей головного мозга пока описана не полностью.
Как следует из эксперимента, первичным источником сигнальных молекул, привлекающих СК, являются клетки опухоли. Способность клеток МГБ продуцировать коллаген IV типа, лектины и тенасцин доказана. Продукция клетками МГБ матриксных металлопротеаз (MMP1, 2 и 9) способствует разрушению внеклеточного матрикса (ВКМ) и высвобождению фибронектина, витронектина и ряда других молекул, резко повышающих мотильность опухолевых клеток и их способность привлекать стволовые и дифференцированные клетки. Рекрутируя микроглиоциты, астроциты и эндотелиальные клетки, МГБ индуцируют продукцию металлопротеаз, что усиливает процессы деградации ВКМ. Поскольку инвазивные свойства МГБ ассоциированы именно с ОСК, то наблюдаемая в эксперименте лучшая подвижность ГСК и НПК относительно ОСК позволяет предположить, что способность привлекать СК не только находится в зависимости от инвазивного потенциала опухоли, но и усиливается в процессе реализации этого потенциала.
Таким образом, в эксперименте in vitro изучены процессы направленной миграции СК к ОК различных типов. Установлено, что способность мигрировать к опухолевым клеткам в большей степени свойственна именно тканеспецифическим нейральным прогениторным клеткам. Наилучшей способностью индуцировать миграцию СК обладают ОСК, что свидетельствует о прямой зависимости этого феномена от инвазивного потенциала опухоли. Вектор миграционной активности более выражен между клетками, имеющими единый гистогенетический источник.
ГСК обладают выраженной способностью к миграции в отношении клеток глиальных опухолей. В свою очередь, клетки глиобластомы линии также обладают высокой степенью мобильности и активно перемещаются в поле зрения, «собирая» стволовые клетки. На принципиальное значение адгезии стволовых и опухолевых клеток указывали Greenbaum (2013), Pittenger (2008), Sohin (2003) и ряд других авторов, отметивших принципиальную возможность колаборации между ними. При этом важно, что ГСК не являются сугубо адгезионной культурой и выявленная нами и описанная в литературе способность СК этого типа адгезировать к клеткам злокачественных опухолей является важным условием, определяющим их роль в опухолевом процессе.
Мысли о противоопухолевых свойствах ГСК высказываются более 50 лет, однако механизмы этого явления неясны. Показана способность ГСК подавлять процессы роста клеток рака поджелудочной, предстательной желез и ряда некоторых линий меланомы, клеток первичного лейкоза, саркомы Капоши, гепатомы и рака молочной железы. В качестве механизмов этого феномена указывается подавление CD34+-клетками процессов сигнальной трансдукции по внутриклеточному пути MAPK и особая роль активизации ГСК лиганд-рецепторных осей CXCR4/SDF, VLA4/VCAM1, CD62L/PSGL, CD44/HA b Kit/KL (Nervi et al., 2006) в опухолевых клетках. Высказывается мнение, что активное привлечение ГСК в опухолевый очаг, осуществляемое через активацию этих сигнальных механизмов, имеет целью трансформацию их в резидентные макрофаги с последующей презентацией опухолевых антигенов (Ratajczak et al., 2003; Sainathan et al., 2008). Как показано в литературе, адгезия ГСК к поверхности клеток опухоли (Sahin et al., 2012) снижает степень их мобильности, подавляя индуцированный TGF-β-синтез компонентов межклеточного матрикса и препятствуя метастазированию (Xiang et al., 2015).
Важной особенностью процесса коммуникации ГСК с клетками опухолей является перенос флуоресцентной метки между ними. В настоящей работе использовались красители на основе сукцинимидного эфира 5,6-карбоксилфлуоресцеин диацетата, обладающего липофильными свойствами, благодаря чему они легко проникают сквозь клеточную мембрану в процессе окрашивания. В цитоплазме клетки молекула красителя ковалентно взаимодействует с аминогруппами цитоплазматических белков (Rahman et al., 2015), благодаря чему метка не высвобождается из клеток и приобретает способность флуоресцировать. Это позволяет рассматривать сущность выявленного в настоящем фрагменте работы феномена переноса флуоресцентной метки именно как трансфер цитоплазматических белков, неразрывно связанных с клеточным красителем. При этом транспорт белков происходит преимущественно между ГСК и опухолевыми клетками разных линий, что, очевидно, представляет собой закономерность межклеточного взаимодействия в данной системе.
Особый интерес представляют механизмы данного явления. Существуют данные о возможности клеточной фузии, или слияния стволовой и неопластической клеток (Чумасов и др., 2010). Этот механизм играет важную роль в регуляции стволовыми клетками процессов детерминации, индукции и дифференциации, коррекции нарушений в поврежденных клетках, репарации и регуляции фенотипа стволовых клеток костного мозга (Wurmser et al., 2002).
Обмен флуоресцентной меткой возможен через экзосомы (Xu et al., 2015), в пользу чего свидетельствует наличие большого количества флуоресцирующих объектов мелкого размера существенно меньше диаметра ГСК. Обмен экстрацеллюлярными везикулами с белками и микроРНК возможен также через особые дифференцировки цитоплазмы – наноразмерные микротрубки (Godlewski et al., 2015), образуемые между мембранами взаимодействующих клеток, либо путем формирования структурно-функционального синцития между стволовыми и опухолевыми клетками.
В ходе эксперимента при взаимодействии стволовых и опухолевых клеток мы наблюдали рад принципиальных моментов. Так, способность ГСК к подавлению ключевых функций опухолевых клеток носит дозозависимый характер, что в известном смысле объясняет конечный биологический смысл их миграции в опухолевую ткань. Резонно предположить, что существенная разница между количеством СК в молодом и пожилом возрасте является одной из причин преобладания злокачественных опухолей во 2-й половине жизни.
При сокультивировании ГСК и опухолевых клеток различных типов в соотношении 1:1 становится возможным описать другие принципиальные закономерности. Клетки рака легкого преимущественно накапливают флуоресцентную метку (цитоплазму), привнесенную из ГСК, что, вероятно, является одним из механизмов противоопухолевого действия этого типа клеток. Во втором случае при культивировании ГСК с клетками линии U-87 и MCF-7 наблюдается увеличение количества дважды позитивных клеток при снижении количества ГСК. При этом важно, что к 96 ч наблюдений в сокультуре ГСК с клетками глиобластомы практически не остается стволовых клеток, позитивных только в отношении одного из используемых красителей.
Механизмы данного феномена нуждаются в дальнейшем изучении, однако, исходя из данных эксперимента, нельзя исключить, что специфика наблюдаемых феноменов отражает именно принципиальное существо взаимодействия между клетками данного типа. Так, направленная миграция ГСК к клеткам глиобластомы резко усиливается при активизации различного типа рецепторов лигандами, продуцируемыми как зоной повреждения, так и самими опухолевыми клетками. В ответ на эти стимулы ГСК мигрируют к опухолевым клеткам и адгезируют к ним. Безусловно, это явление носит регуляторный характер, но в процессе взаимодействия с неопластическими клетками ГСК подвергаются воздействию различных протеолитических ферментов, продуцируемых клетками опухоли. С одной стороны, такое воздействие запускает в них процессы апоптоза, что проявляется накоплением в цитоплазме соответствующих белков, с другой – позволяет опухолевым клеткам фагоцитировать фрагменты разрушенных клеток. Весьма вероятно, что накопление в опухолевых клетках проапоптотических и других белков вызывает серьезные сдвиги в эпигенетической регуляции экспрессии генов, что ведет к торможению пролиферации и угнетению жизненных функций опухолевых клеток. Именно при следовании этой логике становится понятным наблюдаемый нами дозозависимый противоопухолевый эффект ГСК.
Таким образом, при совместном культивировании гемопоэтические CD34+ стволовые клетки адгезируют к клеткам злокачественных опухолей, что сопровождается переносом цитоплазматического содержимого из ГСК в опухолевые клетки. Этот феномен наблюдается у 31% клеток глиомы линии С6, у 47% клеток рака легкого А549 и аденокарциномы молочной железы и у 64% клеток линии U-87 глиобластомы человека. Увеличение соотношения в системе «опухолевые клетки / ГСК» в сокультуре сопровождается замедлением темпов пролиферации опухолевых клеток.